جستجو
ورود
  27 مهر 1397

  تولید رده های سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان ناک اوت شده PTEN بوسیله ویرایش ژنوم به واسطه CRISPR/Cas9

تاریخ انتشار: جمعه 20 بهمن 1396 | امتیاز: Article Rating

سرکوب کننده توموری PTEN در تنظیم تکثیر سلولی، تعیین رده ای، تحرک، چسبندگی و آپوپتوز دخیل است. نشان داده شده است که از دست رفتن PTEN در سلول های بنیادی مزانشیمی استخوان(BMSCs) عملکردشان در ترمیم بافت را تغییر می دهد. تا کنون، سیستم CRISPR/Cas9 نهایت سادگی و انعطاف پذیری را نشان داده است. با استفاده از این سیستم برای دستکاری PTEN، ویرایش ژن می تواند سوش های ناک اوت شده برای PTENیا PTEN-KO‌را تولید کند. ما PTEN را در سلول های بنیادی مزانشیمی ناک اوت کردیم و عدم بیان آن را بوسیله PCR و وسترن بلات اثبات کردیم. برای شفاف سازی تغییرات در تکثیر، سنجش CCK-8 استفاده شد. جهت  حمایت، نسبت سلول های زنده بوسیله رنگ آمیزی تریپان بلو ارزیابی شد. برای القای استخوان زایی و چربی زایی، سلول ها در محیط مختلف برای دو هفته کشت شدند . رنگ آمیزی Oil Red و آلیزارین رد برای ارزیابی تمایز استخوانی و چربی صورت گرفت. بیان Id4، Runx2، ALP و PPARγ بوسیله qPCR و رنگ آمیزی ایمنوسیتوشیمی بررسی شد. سوش PTEN-KO بوسیله توالی یابی شناسایی شد. سلول های PTEN-KO زنده مانی سلولی افزایش یافته و بقای بالاتری در مقایسه با نمونه وحشی داشتند. با این حال، بیان کاهش کاهش یافته Runx2 و PPARγ در سوش فاقد PTEN بعد از القا مشاهده شد که که با تمایز استخوانی و چربی مشاهده شد بوسیله رنگ آمیزی آلیزارین رد و Oil Red مطابقت داشت. در مجموع، سوش PTEN-KO یک قابلیت تکثیری افزایش یافته را نشان داد اما پتامسیل تمایزی چند جهتی آن کاهش یافت. زمانی که سلول های بنیادی مغز استخوان به عنوان سلول مورد نیاز برای مهندسی بافت استفاده می شوند، ژن PTEN می تواند به عنوان یک نشانگر استفاده شود.

Cytotechnology. 2018 Jan 31. doi: 10.1007/s10616-017-0183-3. [Epub ahead of print]

Generation of PTEN knockout bone marrow mesenchymal stem cell lines by CRISPR/Cas9-mediated genome editing.

Shen Y1, Zhang J1, Yu T2, Qi C3.

Abstract

The tumor suppressor PTEN is involved in the regulation of cell proliferation, lineage determination, motility, adhesion and apoptosis. Loss of PTEN in the bone mesenchymal stem cells (BMSCs) was shown to change their function in the repair tissue. So far, the CRISPR/Cas9 system has been proven extremely simple and flexible. Using this system to manipulate PTEN gene editing could produce the PTEN-Knocking-out (PTEN-KO) strain. We knocked out PTEN in MSCs and validated the expression by PCR and Western blot. To clarify the changes in proliferation, CCK-8 assay was applied. In support, living cell proportion was assessed by Trypan blue staining. For osteogenic and adipogenic induction, cells were cultured in different media for 2 weeks. Oil red staining and alizarin red staining were performed for assessment of osteogenic or adipogenic differentiation. The expression of Id4, Runx2, ALP and PPARγ was examined by qPCR and immunocytochemistry staining. The PTEN-KO strain was identified by sequencing. The PTEN-KO cells had an increased cell viability and higher survival compared with the wild type. However, decreased expression of Runx2 and PPARγ was found in the PTEN loss strain after induction, and consistently decreased osteogenic or adipogenic differentiation was observed by alizarin and oil red staining. Together, PTEN-KO strain showed an increased proliferation capability but decreased multi-directional differentiation potential. When BMSCs serve as seed cells for tissue engineering, the PTEN gene may be used as an indicator.

PMID: 29387984
ثبت امتیاز
تبلیغات
تبلیغات
آرشیو سالانه
آرشیو سالانه
نظرات خوانندگان
نظرات خوانندگان