جستجو
ورود
  24 مهر 1397

  تمایز سلول های iPS انسانی به پدوسیت های دارای عملکرد

تاریخ انتشار: ﺳﻪشنبه 17 مهر 1397 | امتیاز: Article Rating

پدوسیت ها، نقش حیاتی را در عملکرد سد گلومرولی(هم در سلامتی و هم در بیماری) بازی می کنند. با این حال، نگهداری پدوسیت های کاملا تمایز یافته در شرایط درون تنی در شرایط کشت آزمایشگاهی مشکل است. سلول های بنیادی پرتوان القایی(iPSCs) یک فرصت منحصربفرد را برای تمایز مستقیم به پدوسیت های بالغ فراهم می کنند. پروتکل تمایزی موجود برای تولید سلول های شبه پدوسیتی مشتق از iPSC یک روش قوی و تکرار پذیر را برای بدست آوردن سلول های شبه پدوسیتی طی دوره ده روزه ارائه می دهد که می توانند برای تحقیقات آزمایشگاهی و مهندسی زیست پزشکی استفاده شوند. پروتکل های منتشر شده قبلی بوسیله تست محیط های تمایزی، فاکتورهای رشد، تراکم کشت سلول و دوره های زمانی مختلف بهبود یافت. برای بهینه سازی و ساده سازی برای یک رویکرد تمایز تک مرحله ای، تغییراتی صورت گرفت. بر عکس پروتکل های قبلی، سلول های چسبنده برای تمایز استفاده شد، استفاده از سروم جنینی گاو(FBS) به حداقل رسید و بنابراین بتا-مرکاپتو اتانول حذف شد. تراکم ذخیره های iPSC و هم چنین ترامن کشت برای کشت تمایزی به عنوان یک پارامتر حیاتی برای نتایج تمایز تنظیم شد. پدوسیت های انسانی به طور شرطی نامیرا شده به عنوان کنترل های مرجع انتخاب شدند. سلول های شبه پدوسیتی مشتق از iPSC، مورفولوژی خاص پدوسیت های خاص  و بیان مجزای مارکرهای پدوسیتی سیناپتوپودین، پودوسین، نفرین و WT-1 را بعد از ده روز تمایز نشان دادند که بوسیله رنگ آمیزی ایمنوفلورسنس یا آنالیزهای وسترن بلات نشان داده شد. نتایج qPCR تنظیم کاهشی مارکرهای پرتوانی Oct-4 و Sox2 و یک تنظیم افزایشی 9 برابری مارکر پدوسیتی سیناپتوپودین را طی دوره تمایز نشان داد. پدوسیت های کشت شده بازجذب اندوسیتوزی آلبومین را نشان دادند. در سنجش های سمیت شناسی، پدوسیت های بالغ به وضوح به دوکسوروبیسین(Adriamycin™) با تغییرات مورفولوژیک و کاهش در زنده مانی سلولی بعد از 48 ساعت انکوباسیون پاسخ دادند.

PLoS One. 2018 Sep 17;13(9):e0203869. doi: 10.1371/journal.pone.0203869. eCollection 2018.

Differentiation of human iPSCs into functional podocytes.

Rauch C1, Feifel E1, Kern G1, Murphy C2, Meier F3, Parson W4, Beilmann M3, Jennings P1,2, Gstraunthaler G1, Wilmes A1,2.

Abstract

Podocytes play a critical role in glomerular barrier function, both in health and disease. However, in vivo terminally differentiated podocytes are difficult to be maintained in in vitro culture. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) offer the unique possibility for directed differentiation into mature podocytes. The current differentiation protocol to generate iPSC-derived podocyte-like cells provides a robust and reproducible method to obtain podocyte-like cells after 10 days that can be employed in in vitro research and biomedical engineering. Previous published protocols were improved by testing varying differentiation media, growth factors, seeding densities, and time course conditions. Modifications were made to optimize and simplify the one-step differentiation procedure. In contrast to earlier protocols, adherent cells for differentiation were used, the use of fetal bovine serum (FBS) was reduced to a minimum, and thus ß-mercaptoethanol could be omitted. The plating densities of iPSC stocks as well as the seeding densities for differentiation cultures turned out to be a crucial parameter for differentiation results. Conditionally immortalized human podocytes served as reference controls. iPSC-derived podocyte-like cells showed a typical podocyte-specific morphology and distinct expression of podocyte markers synaptopodin, podocin, nephrin and WT-1 after 10 days of differentiation as assessed by immunofluorescence staining or Western blot analysis. qPCR results showed a downregulation of pluripotency markers Oct4 and Sox-2 and a 9-fold upregulation of the podocyte marker synaptopodin during the time course of differentiation. Cultured podocytes exhibited endocytotic uptake of albumin. In toxicological assays, matured podocytes clearly responded to doxorubicin (Adriamycin™) with morphological alterations and a reduction in cell viability after 48 h of incubation.

PMID: 30222766
ثبت امتیاز
تبلیغات
تبلیغات
آرشیو سالانه
آرشیو سالانه
نظرات خوانندگان
نظرات خوانندگان