یادداشت
رنگآمیزی پروتئینها در تمامی سلولهای داخل بافتها و اندامها
محققان به پردازش یکنواخت سلولهای تک در مقیاس ارگان برای فنوتایپسازی مولکولی پرداختند.
امتیاز:
به گزارش پایگاه اطلاع رسانی بنیان، محققان موسسهیMIT فناوری جدیدی را معرفی کردهاند که امکان رنگآمیزی پروتئینها در میلیونها سلول فردی در داخل بافتهای کاملاً سالم را فراهم میآورد. این روش که با نام "توزیع مجدد پیوسته تعادل حجمی" (CuRVE) شناخته میشود، فرآیند رنگآمیزی را بهطور سریع و یکنواخت انجام میدهد، بهطوریکه میتوان نمونههای بافتی بزرگی مانند کل مغز حیوانات جونده را در یک روز رنگآمیزی کرد. این تحقیق در مطالعهای که در Nature Biotechnology منتشر شده است، تحت عنوان "پردازش یکنواخت سلولهای تک در مقیاس ارگان برای فنوتایپسازی مولکولی حجمی" توضیح داده شده است. این کار گامی تحولآفرین در زمینه پروفایلسازی بیان پروتئین در بافتهای حجیم و متراکم است.
استفاده از روش برش و رنگآمیزی mELAST و سیستم محاسباتی UNSLICE
"به طور معمول، بررسی مولکولها در داخل سلولها نیازمند جدا کردن بافت به سلولهای فردی یا برش دادن آن به لایههای نازک است، زیرا نور و مواد شیمیایی مورد نیاز برای تجزیه و تحلیل نمیتوانند به عمق بافتها نفوذ کنند" گفت دکتر کوانگهان چونگ، نویسنده ارشد و استاد پژوهش در مؤسسه پیکور برای یادگیری و حافظه آزمایشگاه چونگ به طور معمول در تولید پیشرفتهای تصویربرداری پروتئینی شناخته شده است. "آزمایشگاه ما فناوریهایی مانند CLARITY و SHIELD را توسعه داده است که امکان تحقیق روی ارگانهای کامل را با شفافسازی آنها فراهم میکند" افزود چونگ. سال گذشته، تیم این روش تصویربرداری جدیدی را به اشتراک گذاشت که امکان تصویربرداری با وضوح بالا و سرعت بالا از بافت مغز انسان را بدون تخریب آن با استفاده از روش برش و رنگآمیزی mELAST و سیستم محاسباتی UNSLICE برای بهطور یکپارچه به هم پیوستن تصاویر سهبعدی حاصل فراهم میکند. اکنون ما به روشی نیاز داشتیم که ارگانهای کامل را بهطور شیمیایی رنگآمیزی کند تا بینشهای علمی مفیدی کسب کنیم" چونگ اشاره کرد. او روش جدید را با یک آنالوژی توضیح داد: "تصور کنید یک استیک ضخیم را با سس ماریناد میکنید. لایههای بیرونی به سرعت و به شدت سس را جذب میکنند، در حالی که لایههای درونی تا زمانی که گوشت برای مدت طولانیتری در سس قرار نگیرد، تقریباً دستنخورده میمانند. همین اصل در پردازش شیمیایی بافتها نیز صادق است: اگر سلولها در داخل یک بافت به طور یکنواخت پردازش نشوند، نمیتوان آنها را به صورت کمی مقایسه کرد."
چارچوب CuRVE برای رنگآمیزی نمونههای بزرگ بافتی
چالش اصلی در رنگآمیزی نمونههای بزرگ بافتی، مدت زمانی است که طول میکشد تا آنتیبادیها به طور کامل به نمونه نفوذ کنند. "ممکن است هفتهها طول بکشد تا این مولکولها به بافتهای دستنخورده نفوذ کنند، که این امر پردازش شیمیایی یکنواخت بافتهای به مقیاس ارگان را عملاً غیرممکن و بسیار کند میکند. تیم آنها چارچوب CuRVE را برای حل همین مشکل توسعه داد. CuRVE بهطور مداوم یک تعادل پویا از محیط شیمیایی بافت را حفظ میکند و امکان توزیع و رنگآمیزی یکنواخت آنتیبادیها در سراسر بافت را فراهم میآورد. استفاده از CuRVE در این مطالعه نوآوریهایی را در کنترل سرعت اتصال آنتیبادیها و تقویت نفوذ آنها به بافتها در بر دارد. آنها یک شبیهسازی محاسباتی توسعه دادند که به آنها این امکان را میدهد که پارامترهای مختلف از جمله تغییرات در نرخهای اتصال و چگالی بافتها را به صورت مجازی آزمایش کنند.
استفاده از روشی به نام SWITCH
تیم MIT با استفاده از موفقیتهای قبلی خود این رویکرد را در نمونههای واقعی بهکار بردند. آنها ابتدا از روش قبلی به نام SWITCH استفاده کردند که در آن آنتیبادیها به طور موقت خاموش میشوند تا به بافتها نفوذ کنند و سپس اتصال دوباره فعال میشود. SWITCH کاربردهای محدودی دارد که اجازه درمانهای مداوم را به دلیل مواد شیمیایی خشن موجود در این روش نمیدهد. با اسکرین کردن یک کتابخانه از مواد شیمیایی، محققان اسید دئوکسیکولیک را به عنوان کاندیدای ایدهآل برای مدوله کردن سرعت اتصال آنتیبادیها به طور مداوم شناسایی کردند. آنها همچنین فرآیند رنگآمیزی را با تغییر pH یا غلظت اسید و به کارگیری تکنیک دیگری که توسط آزمایشگاه چونگ توسعه یافته است، به نام "الکتروفشار استوکاستیک" بهینهسازی کردند. این روش برای تسریع توزیع آنتیبادیها با استفاده از میدانهای الکتریکی به کار میرود. از طریق ترکیب این تکنیکها برای تأخیر در فعالسازی آنتیبادیها و تغییر سرعت توزیع آنتیبادیها در یک نمونه با استفاده از چارچوب CuRVE، eFLASH به وجود آمد.
رنگامیزی نمونههای بزرگ بافتی با استفاده از eFLASH
تیم موفق شد نمونههای بزرگ بافتی از جمله مغزهای کامل موش و رت، جنینهای کامل موش و بلوکهای بافت انسانی را با استفاده از eFLASH رنگآمیزی کند. آنها در آزمایشهای خود از بیش از ۶۰ آنتیبادی مختلف استفاده کردند و هر نمونه در عرض یک روز رنگآمیزی شد، در حالی که روشهای رایج معمولاً چند روز یا حتی چند هفته طول میکشند. علاوه بر این، این فرآیند نیاز به بهینهسازی مجدد در میان آمادگیهای مختلف نداشت، که نشاندهنده استحکام و تطبیقپذیری آن است. این یک جهش قابل توجه است. در آزمایشهای مقایسهای، دقت رنگآمیزی eFLASH از سلولهای دستکاریشده ژنتیکی که پروتئین فلورسانت برای هدف خاصی تولید میکنند، پیشی گرفت. در برچسبگذاری ژنتیکی، پروتئینهای فلورسانت همیشه به طور همزمان با پروتئین هدف تولید نمیشوند و این پروتئینهای فلورسانت ممکن است با تأخیر بیان شوند و مدت زمان طولانیتری در سلول باقی بمانند، که باعث کاهش دقت برچسبگذاری ژنتیکی میشود. تیم از eFLASH برای رنگآمیزی سلولهای دستکاریشده ژنتیکی به عنوان مقایسه بصری برای بیان پروتئین هدف استفاده کرد. با استفاده از سلولهای بیانکننده پاروالبامین (PV)، آنها "کاهش بسیار متغیر منطقهای سلولهای PV-امونوواکنش در موشهای بالغ وحشی را کشف کردند، یک پدیدارشناسی که با برچسبگذاری ژنتیکی رایج از دست رفته بود." به طور خلاصه، هر روش هم همپوشانی و هم تفاوتهایی در بیان پروتئین هدف در سلولهایی که با مهندسی ژنتیکی و eFLASH برچسبگذاری شدهاند، نشان میدهد. یون خاطرنشان کرد که این دو روش "ابزارهای متفاوتی برای کار هستند."
استفاده از روشهای برچسبگذاری ژنتیکی و آنتیبادی
نویسندگان بر جنبه مکمل بودن روشهای برچسبگذاری ژنتیکی و آنتیبادی تأکید کردند و پیشنهاد کردند که ترکیب هر دو روش میتواند درک دقیقتری از بیان پروتئینها ارائه دهد. همانطور که نویسندگان نوشتند، "کشف کاهش بزرگ منطقهای سلولهای PV-امونوواکنش در موشهای بالغ سالم و با تغییرات فردی بالا اهمیت فنوتایپسازی جامع و بدون تعصب را برجسته میکند." چارچوب CuRVE و پیادهسازی آن در eFLASH یک پیشرفت عمده در تجزیه و تحلیل سلولهای تک حجمی است. با امکان رنگآمیزی جامع پروتئین در نمونههای بزرگ، این فناوری پتانسیل ایجاد بینشهای بیشتری در زمینههای علوم اعصاب و سایر حوزهها را دارد.
پایان مطلب/.