به گزارش پایگاه اطلاع‌رسانی بنیان،  مقاله‌ای با عنوان "استراتژی توالی‌یابی با توان بالا برای پروفایل‌سازی بالینی زنجیره بتا گیرنده سلول T: توسعه و مقادیر مرجع در بزرگسالان سالم، کودکان و واحدهای خون بند ناف" در مجله International Journal of Molecular Sciences منتشر شد. این پژوهش که توسط تیمی به سرپرستی اِما اِنریچ و فرانسِسک رودیلا از آزمایشگاه ایمونوژنتیک و هم‌خونی بانک خون و بافت بارسلونا، اسپانیا، انجام شده، یک روش مبتنی بر توالی‌یابی نسل جدید (NGS) برای تحلیل زنجیره بتا گیرنده سلول T (TCRβ) توسعه داده و مقادیر مرجع تنوع repertoir را در 74 داوطلب سالم، شامل 44 بزرگسال، 20 کودک و 10 واحد خون بند ناف (CBUs)، تعیین کرده است. همچنین، این روش بر روی چهار بیمار کودک مبتلا به نقص ایمنی ترکیبی (CID) یا نقص ایمنی شدید (SCID) ناشی از جهش‌های مضر در ژن‌های فعال‌کننده بازترکیبی (RAG) آزمایش شده است. این مطالعه نشان می‌دهد که زنجیره بتا گیرنده سلول T، با تنوع بالای خود که از بازترکیبی ژن‌ها و افزودن نوکلئوتیدهای غیرقالب (N) در ناحیه مکمل‌ساز 3 (CDR3) ناشی می‌شود، نقش کلیدی در پاسخ ایمنی تطبیقی دارد. نتایج حاکی از آن است که این روش با دقت بالا، قابلیت تکرارپذیری و حساسیت قابل‌توجه، می‌تواند به تشخیص و پایش بیماری‌های مرتبط با اختلالات repertoir سلول T کمک کند.

 اهمیت گیرنده سلول T و تنوع آن

لنفوسیت‌های T، به‌ویژه نوع αβ که حدود 95 درصد لنفوسیت‌های T در گردش را تشکیل می‌دهند، با بیان زنجیره‌های α و β در گیرنده‌های خود (TCRs)، آنتی‌ژن‌های ارائه‌شده توسط مولکول‌های HLA را شناسایی می‌کنند. تنوع repertoir سلول T، که از بازترکیبی ژن‌های متغیر (V)، تنوعی (D) و اتصالی (J) در زنجیره β و ژن‌های V و J در زنجیره α طی توسعه سلول T در تیموس ایجاد می‌شود، امکان شناسایی طیف گسترده‌ای از آنتی‌ژن‌ها را فراهم می‌کند. لocus ژن‌های کدکننده زنجیره β (TRB) روی کروموزوم 7 قرار دارد و شامل 68 ژن V (TRBV)، 2 ژن D (TRBD) و 14 ژن J (TRBJ) یا شبه‌ژن‌هاست، در حالی که لocus زنجیره α (TRA) روی کروموزوم 14 با 61 ژن TRAV و 61 ژن TRAJ قرار دارد. ناحیه CDR3، که با افزودن نوکلئوتیدهای N در محل اتصال بخش‌های V(D)J شکل می‌گیرد، بیشترین تنوع را دارد و در تعیین اختصاصیت TCR برای کمپلکس پپتید-HLA نقش اصلی را ایفا می‌کند. این فرآیند، همراه با ترکیب زنجیره‌های α و β برای تشکیل TCR عملکردی، repertoir یک فرد سالم را به بیش از 108 گیرنده می‌رساند.

در مقایسه با روش‌های سنتی مانند توالی‌یابی سانگر، طیف‌سنجی یا سیتومتری جریان، توالی‌یابی نسل جدید (NGS) امکان مطالعه عمیق‌تر و کارآمدتر تنوع TCR را فراهم کرده است. استفاده از DNA یا RNA برای تحلیل TCR، با تمرکز بر زنجیره β به دلیل تنوع ترکیبی بالاتر ناشی از حضور ژن D، در مطالعات بالینی رو به افزایش است. این فناوری امکان شناسایی همزمان توالی‌های نوکلئئوتیدی CDR3 از هزاران کلونوتایپ مختلف در یک فرد را فراهم می‌کند، که نه‌تنها تنوع repertoir را نشان می‌دهد، بلکه امکان شناسایی و پایش کلون‌های T موردنظر را نیز فراهم می‌کند. این رویکرد در تشخیص گسترش کلونال یا تغییرات تنوع TCR در سرطان، عفونت، بیماری‌های خودایمنی و نقص ایمنی، پایش بازسازی لنفوسیت‌ها پس از پیوند سلول‌های بنیادی خون‌ساز، و توسعه درمان‌های مبتنی بر سلول T کاربرد دارد.

 توسعه استراتژی توالی‌یابی TCRβ

این مطالعه با هدف توسعه یک روش مبتنی بر DNA ژنومی (gDNA) برای توالی‌یابی TCRβ طراحی شده که برای استفاده در محیط‌های بالینی مناسب باشد. انتخاب gDNA به جای RNA تضمین می‌کند که مقدار DNA با تعداد سلول‌های تحلیل‌شده متناسب است و تحت تأثیر سطوح بیان سلولی قرار نمی‌گیرد، که این امر امکان تعیین فراوانی نسبی هر کلونوتایپ TCRβ در repertoir تحلیل‌شده را فراهم می‌کند. همچنین، پایداری بیشتر gDNA و عدم نیاز به رونویسی معکوس، این روش را برای آزمایشگاه‌های بالینی عملی‌تر می‌سازد. این استراتژی با طراحی 51 پرایمر جلو و 14 پرایمر معکوس اختصاصی برای ژن‌های TRBV و TRBJ، و استفاده از توالی‌های جهانی در انتهای 5' برای آماده‌سازی کتابخانه، اجرا شد. بهینه‌سازی این روش با آزمایش‌های مختلف آمplification، فهرست‌بندی و تصفیه، به یک فرآیند دومرحله‌ای PCR منجر شد که محصول PCR را مستقیماً برای آماده‌سازی کتابخانه استفاده می‌کند، بدون نیاز به مراحل اضافی مانند visualisation ژل یا رقیق‌سازی.

نتایج نشان داد که این روش دارای ویژگی‌های برجسته‌ای از جمله اختصاصیت بالا، تکرارپذیری و حساسیت است. تمام ژن‌های متغیر و اتصالی عملکردی با حداقل بایاس PCR شناسایی شدند. ارزیابی اختصاصیت و کارایی پرایمرها با استفاده از قطعات DNA مصنوعی نشان داد که پرایمرهای TRBJ نسبت به پرایمرهای TRBV اختصاصیت بیشتری دارند، و برخی پرایمرهای TRBV می‌توانند ژن‌های بدون همولوژی دقیق را نیز amplifiy کنند. با تنظیم نسبت پرایمرها، کارایی بهینه‌سازی شد و پخش داده‌ها کاهش یافت، که نشان‌دهنده کاهش بایاس چندگانه PCR است. همچنین، تحلیل خطوط سلولی T مشخص‌شده نشان داد که 100 درصد تطابق در تعیین ناحیه CDR3 و تخصیص بخش‌های TRB به دست آمد.

 تکرارپذیری، حساسیت و نمونه‌های کاری

تکرارپذیری این روش با تحلیل تکرارهای یک pool DNA مصنوعی در شرایط مختلف تأیید شد، که ضریب تطابق لین (Lin’s CC) بالای 0.915 را نشان داد. حساسیت نیز با مخلوط کردن خط سلولی T MOLT-13 در نسبت‌های مختلف با repertoir متنوع T تأیید شد، که فرکانس خوانش مورد انتظار را در همه نسبت‌ها (از 1:1 تا 1:105) نشان داد. برای تعیین نوع نمونه‌ها و مقدار بهینه سلول‌های T، DNA از خون محیطی، سلول‌های تک‌هسته‌ای خون محیطی (PBMCs)، لکوآفروز، سلول‌های غنی‌شده CD3+ و سلول‌های T منبسط‌شده in vitro استفاده شد. اختصاصیت متوسط 91.97 درصد با بیش از 80 درصد در همه انواع نمونه‌ها و مقادیر اولیه DNA (10-800 نانوگرم، معادل 1500 تا 120,000 سلول T) به دست آمد. این نتایج نشان می‌دهد که تعداد بالاتر سلول‌های CD3+ برای مطالعه عمیق‌تر repertoir متنوع T مفید است، هرچند شاخص‌های تنوع، فرکانس‌های استفاده از ژن‌های TRB و طول CDR3 در تکرارها با تعداد مختلف سلول‌ها (10,000، 50,000 یا 100,000) پایدار ماندند.

 مقادیر مرجع تنوع repertoir TCRβ

برای به دست آوردن مقادیر مرجع، 74 داوطلب سالم شامل 44 بزرگسال، 20 کودک و 10 واحد خون بند ناف توالی‌یابی شدند. توزیع طول ناحیه CDR3 در همه گروه‌ها مشابه توزیع گاوسی بود، اما نمونه‌های CBU طول CDR3 و تعداد نوکلئوتیدهای N کمتری داشتند و درصد کلونوتایپ‌های غیرکارکردی بیشتری نشان دادند. همگرایی در گروه‌های کودکان و CBUs بالاتر بود، در حالی که تنوع TCRβ در بزرگسالان و داوطلبان با وضعیت سرولوژی مثبت سیتومگالوویروس (CMV) به‌طور قابل‌توجهی پایین‌تر بود. شاخص تنوع نرمال‌شده شانون-وینر و شاخص سیمپسون معکوس در بزرگسالان نسبت به کودکان و CBUs کمتر بود، و با افزایش سن، تنوع کاهش و کلونالیته افزایش یافت. همچنین، تنوع در بزرگسالان با وضعیت CMV مثبت به‌طور قابل‌توجهی کاهش یافت، اما جنسیت یا تعداد پلی‌مورفیسم‌های HLA تأثیر نداشت. ژن‌های TRBV و TRBJ استفاده‌شده، مانند TRBV20-1 و TRBJ2-7، الگویی مشابه در همه گروه‌ها نشان دادند.

 تحلیل repertoir در بیماران RAG-SCID/CID

چهار بیمار کودک مبتلا به RAG-SCID/CID با میانگین 458,310 خوانش توالی‌یابی شدند. این بیماران طول CDR3 کوتاه‌تر، تنوع repertoir کمتر و شاخص‌های شانون-وینر و سیمپسون معکوس پایین‌تری نسبت به کودکان سالم داشتند. توزیع ناهموار repertoir و حضور کلونوتایپ‌های غالب، نشان‌دهنده نقص در فرآیند بازترکیبی V(D)J است. فرکانس‌های استفاده از ژن‌های TRBV و TRBJ در این بیماران نیز به دلیل کلونوتایپ‌های غالب تغییر کرده بود.

 اهمیت بالینی و آینده

این مطالعه یک استراتژی قابل‌اعتماد برای توالی‌یابی TCRβ ارائه می‌دهد که با دقت بالا و بدون نیاز به مراحل پیچیده، برای محیط‌های بالینی مناسب است. مقادیر مرجع تعیین‌شده می‌تواند در تشخیص و پایش بیماری‌هایی مانند سرطان، عفونت، خودایمنی و نقص ایمنی به کار رود. با این حال، چالش‌هایی مانند پیچیدگی ژن‌های TRB و تأثیر تعداد اولیه سلول‌ها بر تنوع مشاهده‌شده باقی است. تحقیقات آینده می‌تواند با استفاده از داده‌های بیشتر و ابزارهای پیشرفته‌تر، دقت این روش را افزایش دهد و کاربرد آن را در درمان‌های شخصی‌سازی‌شده گسترش دهد.

پایان مطلب/  .